• Session  
  • Du 14 au 16 mai 2018 à Lyon
  • Du 8 au 10 octobre 2018 à Paris
  • // De 9h00 à 17h00
  • Durée : 3 journées – 21 heures
  • Pédagogie : Effectif : 15 Personnes
    Exercices pratiques et étude de cas.
    Remise de support de cours
    La formation sera sanctionnée par une attestation de formation.
  • Les moyens pédagogiques techniques et d’encadrement : Un videoprojecteur // Une connexion wifi haut débit // Un paperboard // Un support de cours couleur // Un ordinateur individuel (un par auditeur)
  • Frais pédagogiques : 1600 € HT / Académiques : 1450 € HT
  • Intervenant : Mme B. Blanquier
  • Public concerné : Personnels scientifiques et techniques voulant être autonome sur Q-PCR.
  • Référence : BMC-12
  • Les compétences visées

A l’issu de cette formation Q-PCR, les auditeurs seront autonomes sur n’importe quel type de Q-PCR, seront capable d’élaborer un protocole et d’analyser de manière objective l’ensemble des résultats obtenus. Ils auront l’ensemble des éléments nécessaires à l’élaboration d’uns stratégie qui leur fera gagner du temps et améliorera la robustesse et la reproductibilité de leurs expériences.

  • Les prérequis

Il n’y a pas de pré-requis particulier, outre un niveau en Biologie Moléculaire minimum (niveau BTS/IUT) permettant de comprendre les mécanismes d’hybridation et de fusion de l’ADN

  • Moyens permettant de suivre l’exécution de l’action et d’en apprécier les résultats

L’exécution de l’action est suivi par la signature d’émargement par 1/2 journée. Les résultats sont appréciés à l’issue de la formation à travers un entretien avec le responsable formation.

  • Modalités d’évaluation

La formatrice interrogera les auditeurs à la fin de chaque chapitre et une évaluation sous forme d’exercices d’applications et d’un questionnaire seront réalisés en fin de formation.


Programme et déroulé de la formation

Journée 1 : 8h45 – 9h00 : Accueil des participants

9h00 : Début de formation
9h00 – 9h30 : tour de table, présentation ds auditeurs et de la formatrice 9h30 – 12h30 PCR quantitative : Aspect théorique

ANALYSE DE LA COURBE DE DISSOCIATION (MELTING CURVE ANALYSIS)

– Définition du TM
– Spécificité de séquence et TM de l’amplicon – Contaminations
– Dimères d’amorces
– Qualité et validation de la PCR

ETUDE DE LA CINÉTIQUE D’AMPLIFICATION

– Identification et propriétés mathématiques de la phase exponentielle – Bruit de fond des fluorophores
– Seuil de détection (Cp/Ct/Cq)

EFFICACITÉ DE LA PCR

– Définition et utilité E=10 -1/pente
– Calcul de l’efficacité par régression linéaire d’une gamme de dilution
– Validation des amorces : dynamique, linéarité et limite de détection
– Standardisation et validation des manipulations de PCRQ (intra et inter-run) – Les contrôles indispensables

12h30 : Déjeuner

14h00 – QUANTIFICATION PAR PCR EN TEMPS RÉEL

– ARN et ADN génomique
– Quantification absolue
– Quantification relative – Avec et sans correction d’efficacité (2ddCT) – Stratégie de quantification en fonction du contexte biologique

STRATÉGIE DE NORMALISATION

– Définition des gènes de référence (housekeeping gene)
– Choix et validation des gènes de référence : moyenne arithmétique ou géométrique ? – Les outils gratuits à connaître (Genorm, Bestkeeper)

Journée 2 : 8h45 – 9h00 Accueil des participants

9h00 : Début de formation

LES RÉSULTATS

– La reproductibilité
– La sensibilité
– La précision (exact /relatif)
– Les réplicats techniques et biologiques
– Présentation des résultats : Nombre de copies, comparatif, fold change, fold increase – Quelques logiciels à connaître ou paramétrer Excel ?

PUBLICATION ET PCRQ : LES MIQE
VALIDATION DES MICROARRAY ET PCRQ HAUT DÉBIT
– TLDA-Nanostring
DIFFÉRENTES APPROCHES DU GÉNOTYPAGE OU POLYMORPHISME EN PCRQ

– Les sondes d’hybridation
– La PCR digitale
– Le HRM (High Resolution Melt Analysis)

12h30 : Déjeuner

Dessin des amorces de PCRQ STRATÉGIE EFFICACE DE DESIGN EN 5 ÉTAPES FACILES : – HUGO nomenclature du gène – ENSEMBL : connaître son gène pour définir la séquence à amplifier – Organisation intron exon ; séquences codantes,UTR ; isoformes – Logiciels et outils de design – Beacon designer : pourquoi c’est le meilleur .BLAST et MFOLD Les paramètres à spécifier pour les amorces et les amplicons – UPL de Roche – Les banques d’oligonucléotides – Amplify : la PCR électronique très prédictive et gratuite – Commande, test et validation des oligos

17h00 : Fin de formation

Journée 3 : 8h45 – 9h00 Accueil des participants 9h00 : Début de formation PCR Quantitative : aspect pratique

PRÉCAUTIONS ET RISQUES BIOLOGIQUES MISE EN PLACE D’UN PROJET DE QUANTIFICATION : LES POINTS À CONSIDÉRER

LES ÉQUIPEMENTS : THERMOCYCLEURS, CIRCUIT PCR, NANODROP, BIO ANALYSEUR LES CONSOMMABLES LES KITS

PROTOCOLES ET OPTIMISATION
ECHANTILLONS, ARN, CDNA, ADN : NATURE, QUALITÉ, EXTRACTION, QUANTIFICATION, CONSERVATION

LA REVERSE TRANSCRIPTION : UNE ÉTAPE CLÉ À OPTIMISER EN PERMANENCE

– Quantité ARN
– Le traitement à la Dnase
– Les différentes enzymes
– La stratégie d’amorçage et sensibilité détection
(oligotDT random primers ou amorce spécifique)
– Rendement de la RT et vérification
– Les contrôles de RT
– Les kits de RT

LE CDNA
DÉTECTER LES INHIBITIONS DE LA PCR
LES AMORCES
LA GAMME D’ÉTALONNAGE
LES CONTAMINATIONS ET CROSS CONTAMINATIONS

12h30 : Déjeuner

Analyse et Exploitation des résultats :
PROGRAMMATION DES RUNS
PRÉSENTATION DU LOGICIEL DU STEPONE PLUS
ANALYSE DES RUNS – SAVOIR IDENTIFIER LES ERREURS
LE PIÈGE DES (MAUVAIS) ALGORITHMES DE DÉTECTION DU SEUIL CALCUL ET EXPLOITATION DES RÉSULTATS DANS EXCEL PRÉSENTATION D’OUTILS GRATUITS POUR LES CALCULS OU LA NORMALISATION : REST, BESTKEEPER

PRÉSENTATION D’OUTILS BIO-INFORMATIQUES POUR LE DESIGN DES AMORCES : HUGO, ENSEMBL, BLAST, UPL, PRIMER BLAST, AMPLIFY ETC. BIBLIOGRAPHIE

16h00 : Tour de table, échange avec le formateur 16h15 : Evaluation des compétences par questionnaire 16h30 : Evaluation de la formation par les auditeurs

17h00 : Fin de formation

OBJECTIFS

  • Présenter tous les paramètres des cinétiques d’amplification et de dissociation et de souligner leur importance dans les calculs de quantification
  • Souligner l’impact du choix des amorces sur les résultats
  • Rendre le design des amorces accessible
  • Trouver une bonne stratégie pour gagner beaucoup de temps et d’efficacité
  • Comprendre l’importance de la rigueur extrême nécessaire dans cette technique à chaque étape afin d’obtenir reproductibilité et fiabilité des résultats

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