Formation théorique

Méthodes de préparation des échantillons biologiques pour le séquençage nouvelle génération (NGS)

  • Sessions :
    • Les 12 & 13 octobre 2020 à Lyon
    • Les 21 & 22 juin 2021 à Lyon

// De 9h00 à 17h00

  • Durée : 2 journées – 14 heures
  • Pédagogie : Effectif : 12 Personnes

Exercices d’application et études de cas.

Evaluation réalisée selon un QCM sur les connaissances de base (50%) et sur les connaissances spécifiques (50%)
La formation sera sanctionnée par une attestation de formation.

  • Moyens pédagogiques et techniques d’encadrement :

Un vidéoprojecteur // Connexion WIFI haut-débit // Un support de cours couleur // Un paperboard

  • Accessibilité :

Formation accessible au public à mobilité réduite – Adaptation des moyens de la prestation aux personnes en situation de handicap

  • Référence : BMC-19
  • Frais pédagogiques

1050 € HT / Académiques : 950 € HT

Déjeuners offerts

  • Formateur :

Dr. J. Lachuer

  • Public concerné :

Personnels scientifiques, techniques, chercheurs, ingénieurs, techniciens, médecins, biologistes.

  • Prérequis :

Notions de Biologie Moléculaire


PROGRAMME

Préparation d’échantillons pour le séquençage NGS dans le cadre d’étude sur le transcriptome, génome, régulome, épigénome et métagénome.

Les techniques de prélèvement, de transport, de conservation des échantillons biologiques.

Les techniques d’extraction d’acides nucléiques (ARN, ADN, miRNA) sur échantillons frais, congelés ou fixés.

Le cas des plantes, des insectes, des bactéries et d’échantillons complexes.

Les méthodes de quantification et de qualification des acides nucléiques. La détection de contamination.

Les techniques d’amplification des ADN, ARN ou miRNA avant séquençage.

Les technologies de séquençage

Les technologies de séquençage  2ème et 3ème génération

Le vocabulaire du séquençage (notion de profondeur, couverture…)

Quelle technologie choisir en fonction des analyses à réaliser (courts ou longs fragments)

Les méthodes d’analyse du transcriptome et du miRNome.

Les techniques de mRNA-seq ou de wholeRNA-seq (eucaryotes, procaryotes et virus)

Les analyses possibles à partir de données RNA-seq (étude de polymorphismes, ARN fusion, variants d’épissage, etc..)

RNAseq sur cellules fixées ou échantillons dégradés

RNAseq sur microquantités (<1ng)

Les techniques d’enrichissement d’ARN

Les techniques de séquençage de novo

Le séquençage des miRNA (smallRNA-seq)

Exemple d’analyse à partir d’exosomes ou de fluides biologiques

Autres applications du NGS sur les ARN (GROseq, RIPseq, CLASHseq)

Questions diverses : quelle profondeur de séquençage, les contrôles qualité, le nombre de réplicats biologiques,….

Les méthodes d’analyse du génome et du régulome

Les techniques de DNA seq (eucaryotes, procaryotes et virus)

Les techniques d’enrichissement de génome ou partie de génome

DNAseq sur cellules fixées (FFPE) et échantillons dégradés

DNAseq sur microquantités

Application pour l’étude de variants structuraux

Application au séquençage de novo

Principes et applications de quelques technologies (ATAC seq, FAIRE seq…..)

Etude de la méthylation par BS-seq (Bisulfite séquencing)

Etude de la méthylation par RRBS (Reduced representation bisulfite sequencing)

Etude de régulome par ChIP-seq

Questions diverses : quelle profondeur de séquençage, les contrôles qualité, le nombre de réplicats biologiques,….

Etude du métagénome

Dans ce chapitre sont abordées les technologies permettant de caractériser une population bactérienne, virale ou fongique dans différents contextes de microbiote.

Les technologies d’analyse abordées seront :

Analyse de rADN 16S (bactéries)

Analyse des ITS (Internal Transcribed Spacer)

Analyse par  Shotgun

Les technologies d’enrichissement de génome ou transcriptome par rapport à des génomes hôtes seront présentées et des exemples de cas analysés au cours de la séance.

Autres applications du NGS

Dans ce chapitre seront abordées les technologies permettant de rechercher l’association entre génotype et phénotype dans différents systèmes biologiques.
Ces technologies abordées seront :

Le transposon-Seq (Tn-seq, INS-seq),

Le barecoding seq (Bare-Seq)

Autres technologies

Les technologies d’analyse génomique sur cellules uniques

Les technologies de séparation des cellules individuellement (capture laser, techniques de dropplet, de microfluidique, de dilution, de DEP, etc…)

Les approches pour l’analyse du transcriptome, du génome et du méthylome sur cellules uniques.

OBJECTIFS/COMPÉTENCES :

  • Connaitre les principaux protocoles d’extraction des acides nucléiques, les méthodes d’évaluation de leur qualité, les méthodes de quantification, les méthodes de conservation et les méthodes de transport des échantillons ou des acides nucléiques
  • Détecter et résoudre des problèmes liés à l’extraction (présence de polluants)
  • Connaître les différentes approches de séquençage haut débit pour l’étude de génotypes chez des espèces modèles ou non
  • Connaitre les différentes approches de séquençage haut débit pour l’étude du transcriptome chez des espèces modèles ou non
  • Connaitre les techniques d’amplification d’ARN et d’ADN avant la construction de librairies pour le séquençage
  • Evaluer la qualité d’une analyse de séquençage (qualité des extractions d’acides nucléiques, qualité des librairies, qualité des données de séquençage)
  • Dessiner une expérience en fonction de la problématique biologique posée
  • Calculer des profondeurs de séquençage, des couvertures de séquençage
  • Choisir entre une stratégie single read et paired end
  • Choisir la taille des séquences à générer
  • Savoir multiplexer des analyses
  • Connaitre les principes de combinaisons d’index
  • Connaitre les techniques d’enrichissement cellulaires

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